Introdución

Todos los acuaristas de arrecife están bien conscientes de qué tan propensos están a desastres en sus acuarios. Uno de los sabios consejos en nuestro pasatiempo dice que: "los desastres ocurren rápidamente, el éxito requiere tiempo y paciencia." De aquí, el mensaje es claro; cuando las cosas van mal, los problemas resultantes a menudo ocurren rápidamente. Conscientes de la naturaleza precaria de nuestros ecositemas artificiales, la mayoría de los aficionados hacen todo lo que está a su alcance para asegurar que sus bellas y caras criaturas no mueran. Muchos aficionados tienen sistemas de emergencia contra fallas en al energía electrica, fallas en los equipos, problemas en los niveles de agua e imbalances químicos. Es irónico y desafortunado que todas estas medidas de seguridad se vean grandemente amenazadas por el uso de sal artificial que, debido a su pobre formulación, pudiera estar envenenado los animales que el aficionado trata de proteger.

Entre los Biólogos Marinos profesionales, en particular aquellos que trabajan con embriones de invertebrados, la mezcla de sales para sal marina artificial promedio ha sido reconocida por muchos años como un substituto imperfecto para lo que es el medio perfecto para crecimiento de animales marinos, agua salada oceánica pura. Esto aplica en especial para organismos delicados como embriones (Strathmann, 1987). Los organismos marinos han evolucionado en agua de mar natural y la selección natural ha hecho los ajustes finos de su fisiología a este medio. Muchos de estos organismos no tienen pieles a prueba de agua y el bienestar de la criatura depende directamente de la solución que lo rodea. Mientras que hay una tolerancia a variaciones de la condición "normal" para las que los animales están preparados, generalmente esa tolerancia es pequeña y limitada al rango de variación natural (Prosser, 1991).

El agua de mar no es sólo una solución de cloruro de sodio y agua, sino es mas bien una mezcla compleja y no completamente entendida de virtualmente toda sustancia que ha aparecido en la faz de la tierra. Cualquier cosa que puede ser lavada río abajo eventualmente halla su camino a los mares y es incorporada en la solución de los oceanos (Pilson, 1998). El gran volumen de los océanos del mundo asegura que la concentración de la solución de la mayoría de estos materiales sea muy pequeña, en el rango de partes por billón o menor. Una parte por billón es una cantidad pequeña y para imaginarse una fracción tan chica, a veces es necesaria ayuda. Si suponen que una persona promedio pesa aprox. 75 kilos, una parte por billon sería el equivalente a una carta de una onza en el bolsillo de una persona en un grupo de 416,667. Y sin embargo, los organismos responden a materiales presentes en concentraciones aún más pequeñas que una parte por billón.

Al nivel celular básico, toda la vida depende del funcionamiento correcto de una compleja serie de reacciones químicas interconectadas. Estas reacciones son gobernadas y controladas por enzimas (las enzimas son proteínas N del T) cuyas capacidades se determinan por el ambiente celular interno. En las criaturas marinas, el ambiente celular interno depende directamente del agua de mar en el medio que rodea al organismo. Cambios en la salinidad, por ejemplo, a menudo son directamente responsables de cambios en el metabolismo celular. Adicionalmente, los químicos disuletos en el agua de mar pueden afectar directamente la función celular. Esto es particularmente cierto para los iones metálicos en el agua de mar.

Los iones metálicos resultan de la disolución de alguna sal metálica en el agua y a menudo son muy importantes en la función de las enzimas. En cantidades apropiadas, varios iones metálicos aseguran que las enzimas tengan la forma correcta y realicen la función adecuada. Sin embargo, cuando se encuentran en la concentración equivocada, muchos iones metálicos pueden interferir con y cambiar la estructura de, las enzimas. Estos cambios generalmente causan serios problemas al organismo. Por ejemplo, cantidades muy pequeñas de cobre, precisamente esas cantidades encontradas en el agua de mar natural, son absolutamente necesarias para el funcionamiento correcto del pigmento hemocianina (el equivalente a la hemoglonina de nuestra sangre N del T), en los artrópodos y moluscos. Sin embargo, un ligero incremento en la cantidad de cobre que rodea a los organismos resultará en un incremento similar en el ambiente celular interno, causando la desnaturalización (pérdida de la estructura N del T) de otras enzimas, matando a estos mismos organismos.

El cobre no es el único metal que forma iones que interfieren con el metabolismo celular, de hecho, esta interferencia es una propiedad general de la mayoría de los metales, particularmente aquellos que son llamados "metales pesados." Estos son elementos como el cobre, mercurio, hierro, plomo, plata, zinc, vanadio, níquel y varios otros. La letalidad de estos materiales contra toda la vida, incluyendo la humana, es lo que ha impulsado muchas de las regulaciones ambientales relacionadas a las descargas de drenajes en los océanos. Previo a la creación de pesticidas orgánicos, muchos de los pesticidas en uso eran simplemente mezclas de sales de cobre, zinc, arsénico, mercurio y otros "metales traza. " Presentes en concentraciones muy pequeñas, generalmente aquellas encontradas en el agua de mar, la mayoría de estos materiales no son nocivos; sin embargo, en concentraciones ligéramente elevadas matan organismos. (Vean, por ejemplo, Alutoin, et al., 2001; Breitburg, et al. 1999; Goh, y Chou, 1992; Heyward, 1988; Negri, y Heyward, 2001; Reichelt-Brushett y Harrison, 1999).

En el último par de años, he documentado el nivel anormalmente elevado de metales pesados hallado en los sistemas de acuario y he especulado que estos metales están causando algo de la mortalidad o "fragilidad" de organismos que los aficionados expermientan en sus acuarios (Shimek, 2002a-e). Muchos metales pesados son añadidos al acuario contínuamente en las comidas, que son adiciones necesarias al acuario (Shimek, 2001). Los organismos típicamente detoxifican los metales pesados, aún en niveles normales, enlazándolos en forma irreversible a proteínas en sus cuerpos. Esto resulta en la acumulación de materiales tóxicos en el animal a lo largo de su vida. Si esos organismos se usan para preparar comidas para acuario, o se alimenta directamente a los organismos con ellos, la alimentación puede trasnferir cantidades altas y significativas de metales pesados a su sistema.

El viejo lema de los ingenieros del ejército de "la solución a la contaminación es la dilución," es válido y natural en lso arrecifes, la disolución parcial de las comidas, digestión y excreción resultarán en la diseminación y consecuente reducción de las cargas de metales traza potencialmente tóxicas. Sin embargo, en el acuario a diferencia del arrecife verdadero, no hay ningún lugar al que se puedan ir los metales pesados. La filtración y exportación pueden remover algunos de estos materiales, pero no es un proceso particularmente eficiente(Shimek, 2002e), en especial considerando que algunos de estos metales pueden encontrarse en concentraciones excesivamente elevadas.

Sin embargo, mucha de esta concentración excesivamente elevada, no es resultado de la alimentación o aún de procesos ridículos y peligrosos como añadir directamente metales tóxicos al tanque en la forma de aditivos, sino que son el resultado de la formulación de las mezclas de sales (Atkinson and Bingman, 1999). Aunque la toxicidad potencial de tales fórmulas ya ha sido comentada, no había habido pruebas cuantitativas de las aguas hechas con las mezclas artificiales para determinar si eran, por sí mismas, tóxicas a los organismos. Este artículo reporta la primera de esas pruebas.

Materiales y Metodología

Uno de los métodos comunes para probar la toxicidad de el agua es el uso de un bioensayo. Los bioensayos son simplemente pruebas de toxicidad hechas usando organismos vivos colocados en el agua registrando sus reacciones. Son parte común de las pruebas de toxicidad en estudios de agua fresca y salada y lo han sido por varias décadas. El método que decidí usar es una variante de los muchos bioensayos con larvas de erizos que son usados comunmente en pruebas ambientales. Literalmente cintos de variantes de esta prueba están en uso por todo el mundo, con los procedimientos de la prueba ajustado a los animales que se estén manejando y al proyecto. Simplifiqué esta pruba tanto como fue posible para evitar procedimientos laboriosos intensivos. Al hacer esto, sacrifiqué algo de la información que pude haber obtenido de las pruebas. En lugar de eso, me concentré en un enfoque simple de "si/no" preguntando:

"¿Tiene el tipo de sal artificial usado un efecto en el número de larvas que se pueden desarrollar después de que una cierta cantidad de embriones es expuesta al medio específico?"

En breve, para esta prueba, coloqué proximadamente igual número embriones en etapas tempranas de desarrollo (= huevos fertilizados) en vasos de precipitados con varios tipos de agua de mar y después de dos días conté todas las larvas que se habían desarrollado en cada vaso. El número de larvas hallado en cada una de las soluciones fue entonces comparado para determinar diferencias entre las soluciones. Adicionalmente, el número de larvas de las soluciones de prueba se comparó con el número hallado en agua de mar natural (control negativo) y en soluciones de cloruro de cobre, un tóxico conocido (control positivo).

Probé las siguientes sales: Instant Ocean (Aquarium Systems, Inc.), Bio-Sea Marinemix (Aqua Craft, Inc.), Crystal Seas Marinemix - Bioassay Formula (Marine Enterprises International, Inc.) y Coralife (Energy Savers Unlimited, Inc.). Instant Ocean y Coralife se compraron a los "Drs. Foster and Smith." Un paquete sin abrir de Bio-Sea Marine Mix fue proporcionado por un acuarista. La Crystal Seas Marine Mix - Bioassay Formula me fue enviada directamente del fabricante. También probé agua de acuarios de dos aficionados que me mandaron 4 litros cada uno del agua de sus tanques para probar. Esa agua se colectó y envió en contenedores de 4 litros para agua destilada que habían sido comprados; se desechó el agua destilada y los contenedores se llenaron con agua de los tanques. Dado que el agua llegó un tiempo antes de el experimento, se le congeló hasta justo antes de su uso, que fue cuando se le fundió y ajustó a temperatura ambiente. Ambos aficionados preparan el agua de sus tanques con Instant Ocean. Un aficionado usa agua de ósmosis y el otro agua de pozo. El agua de mar natural se obtuvo de Catalina Water Company (1605 Pier D Street, Long Beach, California. 90802).

Un día previo al arribo de los animales para la prueba, preparé 4 litros de cada una de las mezclas de sales a ser probadas. Todos los envases usados en la prueba habían sido lavados con ácido y bien enjuagados en agua destilada, dejándolos secar al aire. Las sales se mezlcaron a una gravedad específica de 1.024 a 24°C para igualarlas al agua de mar. Estas medidas fueron hechas con un higrómetro con una temperatura de referencia de 15.55°C y ajustado para compensar la diferencia entre la temperatura de calibración y la temperatura ambiente. La información acerca de la calibración de higrómetros y su uso está disponible en linea en varias direcciones.

Para cada solución a probarse, hice 11 replicados. 10 replicados fueron empleados en la prueba y no se les tocó durante la prueba una vez que ésta fue iniciada; el otró se usó para observar el desarrollo durante la prueba, si yo creía que era necesario. Cada replicado consistió de 150 ml de la solución en un vaso de precipitado Tri-Stir sin usar. Durante la prueba, los vasos fueron cubiertos con una caja petri de plástico para prevenir la contaminación o evaporación. No se aplicó ni agitación ni aireación. Todos los vasos fueron marcados para indicar la solución que contenían y se les distribuyó aleatoriamente sobre una mesa de mi oficina/laboratorio. Las pruebas se hicieron a temp. ambiente. Esta varió de 22 a 27°C durante el desarrollo del estudio. Estos es un poco más caliente que lo óptimo, pero dentro del rango acepptable para esta especie.

Los animales de prueba fueron Arbacia punctulata, erizos de mar hallados a lo largo de la costa este de EU. Compré 12 erizos de Gulf Specimen Aquarium and Marine Supply, Post Office Box 237, Panacea, FL 32346. Me fueron enviados y se les usó en cuanto llegaron. Los desempaqué y coloqué en un acuario pequeño lleno con agua de mar natural a temp. ambiente. La reproducción se indujo de la manera tradicional, mediante inyección de dos mililitros de cloruro de potasio 0.53M (molar, N del T) a través de la membrana peristomial en el celoma perivisceral. La reproducción se inició inmediatamente en la mayoría de los animales.

Para más información acerca de Arbacia punctulata y su embriología sigan este link: http://database.mbl.edu/Costello/find.taf?function=BB&ID=78

Figura 1. Macho de Arbacia punctulata en reproducción. El animal está boca arriba sobre el vaso de precipitados. Los poros genitales se encuentran en la superficie aboral, por lo tanto, viendo hacia abajo.Periodicamente, enjuago el esperma que colecto del erizo en el agua. Los huevos naranjas obtenidos previamente de una hembra son visibles en el vaso de la izquierda. Los vaoss experimentales cubiertos con cajas de Petri se ven al fondo.

Los huevos se colectan invirtiendo a los erizos sobre los vasos llenos de agua de mar natural. El esperma se colectó enjuagando el esperma de la superficie aboral con ayuda de una pipeta en vasos llenos de agua de mar natural. De los 12 A. punctulata inyectados, 8 fueron machos, 2 hembras y 2 no liberaron gametos. Después de que se completó la liberación de gametos, los huevos fueron lavados mediante agitación, permitiéndoles sedimentar y decantando muy cuidadosamente el agua. Agua de mar natural fresca se agregó y el proceso de lavado se repitió 3 veces. Las suspensiones de esperma se juntaron, se les agitó vigorosamente y una dilución de 1:200 de esperma se mezcló en un vaso nuevo.

Los huevos se examinaron microscópicamente para asegurarse que estaban maduros por la ausencia de una vescícula germinal y forma uniforme. El esperma se analizó microscópicamente para asegurarse de su motilidad. Un mililitro de la suspensión de esperma se agregó al vaso con los huevos y la solución se mezcló completamente con una pipeta. Se colectaron muestras y se les examinó microscópicamente para asegurar que la mezcla fue fertilizada. Una vez que se notó fertilización, aproximadamente un mililitro de la suspensión de huevos fertilizados se pipeteó en cada uno de los replicados (con lo que cada replicado tenía entre 50-80 huevos fertilizados).

Figura 2. Ovulo de Arbacia punctulata previo a la fertilización.

Esta especie se desarrolla rápidamente a las temperaturas usadas en este estudio y después de 48 hrs. la larva ha alcanzado el estadio de pluteus temprano. Este es el primer estadio de alimentación, y dado que no quería complicar las pruebas alimentando los animales, la prueba terminaba en esta etapa. El contenido de los vasos se examinaba bajo una amplificación de 40x y todas las plutei u otras formas larvarias eran contadas y registradas. Esto se hizo para todos los 10 replicados. Generalmente, en esta etapa, las soluciones y las larvas se desecharon.

Análisis estadístico:

Los resultados de las pruebas fueron tabulados y un análisis de varianza (ANOVA) fue realizado. Las varianzas resultantes del ANOVA requirieron pruebas t subsecuentes para las diferencias de los promedios de las muestras bajo la hipótesis de que las muestras tenían varianzas diferentes. Estas pruebas t se hicieron comparando el número de embriones en cada grupo experimental (las cuatro mezclas de sales y los dos tanques de aficionados) contra el número de embriones hallado en agua de mar natural. Todas las pruebas estadísticas fueron hechas con la sección analítica del paquete de hoja de cálculo de Corel Quattro Pro 8.

Resultados:

El número de larvas que se halló después de 48 hrs. varió ampliamente (Tabla1). Las muestras del agua de mar artificial hecha con IO contenían en promedio 4.0 larvas por replicado, mientras que aquellas con coralife promediaron 7.4 larvas por vaso. La muestra del aficionado 2 también contenía un bajo número de larvas, 5.1 vaso. El número de larvas promedio de las muestras con agua de mar natural, Crystal Sea Marinemix-Bioassay Formula y BioSea Marinemix tuvieron un promedio más grande de larvas, variando entre 35.8 a 41.5 larvas por replicado. No había larvas en el agua de mar natural que tenía cloruro de cobre donde la concentración de cloruro de cobre era de 100 ppb o mayor.

El ANOVA indica que la probabilidad de que todas las muestras tuvieran la misma varianza es extremadamente pequeña: P = 9.306 x 10-16 o aproximadamente, uno en 10,000,000,000,000 (Tabla 2).

Figura 5. Larvas de Arbacia pluteus en el cultivo vistas con bajo aumento. Las larvas son las estructuras blancas con forma de flecha.

El número de larvas promedio o la media de cada muestra experimental se comparó contra la media de la muestra control con agua de mar natural usando la prueba t (Tabla 3). Se puede ver que el resultado de las muestras del agua preparada con IO y Coralife, así como las muestras del agua del aficionado B, cada una tiene probabilidades entre 0.00003 y 0.00006 (ó entre 3 y 6 en 100,000) de ser iguales al agua de mar. Por el contrario, los resultados con Crystal Sea Marinemix Bioassay Formula y Bio-Sea Marinemix tienen un 45 y un 85% de probabilidad respectivamente de estar en el mismo grupo de resultados del agua de mar natural. Generalmente, los Biólogos dicen que muestras que son diferentes por más del 5% (o dicho de otra manera, aquellas que tienen menos de 1 oportunidad en 20 de ser obtenidas de la misma población) presentan diferencias estadísticas significativas.

Así que, el número promedio de larvas que se desarrollaron en las muestras hechas con IO y Coralife fue estadísticamente diferente, y mucho menor, que el número que se desarrolló en el agua de mar natural. Por otra parte, el número promedio hallado en mezclas de Crystal Sea Marinemix Bioassay Formula y Bio-Sea Marinemix no fue significativamente diferente del hallado en agua de mar natural.

El número de larvas hallado en las aguas de ambos aficionados fue significativamente diferente del número promedio hallado en el agua de mar natural. Sin embargo, al menos en el caso del aficionado A, el número de larvas promedio fue relativamente cercano al número en agua de mar natural.

Discusión:

Estos datos son correctos y bastante preocupantes. Muestran que el agua obtenida con algunas sales artificiales es significativamente más tóxica para embriones de erizo en desarrollo, y por inferencia hacia otros organismos, que el agua hecha con sales de otros fabricantes. Sería más aceptable, creo, si todas las sales fuesen igualmente tóxicas. Eso indicaría que ningún fabricante se ha imaginado cómo hacer una mezcla de sales decente y si ese fuera el caso, los aficionados sólo tendrían que aprender a vivir con ello. O aprenderían cuáles especies de animales de arrecife son mas tolerantes de tal abuso y pueden sobrevivir en ellas. Sin embargo, ésa no es la situación. La situación es que las aguas hechas con algunas de las sales probadas son menos dañinas y tienen mejor sobrevivencia de larvas de erizo que otras. Al menos las aguas con pobre sobrevivencia de larvas todavia tienen algo de sobrevivencia, pero comparando contra el número de embriones que sobrevive en otras aguas, la mortalidad de los embriones de erizo en agua hecha con IO es de aprox. 90% y en agua hecha con Coralife es de 80%. La respuesta animal a las toxinas es una función biológica y está distribuida en una función estadística "normal", así que las larvas vistas en las aguas de estas dos sales son las mas resistentes de entre las resistentes. Es altamente probable que los efectos de mortalidad no se limiten a las larvas y estén más ampliamente expandidos por el pasatiempo de los acuarios de arrecife. No hay una razón en particular para suponer que los acuarios de arrecife son más benignos que las áreas naturales donde bioensayos similares y otras pruebas como análisis químicos, han mostrado que otros materiales tóxicos están presentes.

Figure 6 . Una pluteus de Arbacia punctulata de 2 semanas. Mantuve unas cuantas larvas vivas en las mezclas Bio-Sea Marinemix y la Crystal Sea Marinemix Bioassay Formula alimentándolas con fitoplanckton, que es visible en el centro del animal como una mancha verde. Los brazos extra en la parte superior del animal ayudan en la alimentación y locomoción; en esta etapa el animal es de 1 mm de largo. (Click para una imagen mayor).

Por supuesto que, siempre es posible que estos datos estén mal, variaciones aleatorias en el bien ordenado universo que constituye el pasatiempo de loa acuarios arrecife. Sería útil si hubiera algún factor potencial definido que pudiera ser la causa de tal